文章目录

1 材料与方法

1.1 材料

    1.1.1 试验动物

    1.1.2 细胞、病毒和载体

    1.1.3 主要试剂

1.2 方法

    1.2.1 NDV TS09-C株cDNA制备和FAdV-4基因组提取

    1.2.2 引物设计及合成

    1.2.3 NDV LaSota株的耐热改造

    1.2.4 重组NDV的构建

    1.2.5 重组NDV的拯救

    1.2.6 重组NDV的生物学特性测定

    1.2.7 重组NDV生长曲线的测定

    1.2.8 重组NDV热稳定性试验

    1.2.9 Fiber2蛋白表达鉴定

    1.2.10 重组NDV免疫试验

    1.2.11 FAdV-4攻毒试验

    1.2.12 统计分析

2 结 果

2.1 重组NDV构建及拯救

    2.1.1 重组质粒pTS-HN的鉴定

    2.1.2 重组质粒pTS-HN-Fiber2的鉴定

    2.1.3 重组NDV的拯救

2.2 重组NDV生物学特性的测定

2.3 重组NDV的生长曲线

2.4 重组NDV的热稳定性

2.5 Fiber2蛋白表达鉴定

2.6 重组NDV免疫试验结果

2.7 FAdV-4攻毒试验结果

3 讨 论

4 结 论

文章摘要:【目的】研究针对新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）和禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）的耐热基因工程疫苗。【方法】利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上,再将禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）的Fiber2基因插入到其基因组上,构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2,并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h,且脑内接种致病指数为0,属于弱毒的范畴;在细胞上的生长曲线结果表明,rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线,但最终的生长滴度略低于LaSota株;rTS-HN-Fiber2在56℃处理15 min后,病毒滴度下降约10³ TCID₅₀/mL,而LaSota株56℃处理5 min几乎无感染性;间接免疫荧光试验结果表明,rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示,rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体,且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率,减轻FAdV-4强毒引起的组织病变,降低组织中的病毒载量。【结论】本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV,该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性,但热稳定性有显著提升;重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护,该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。

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