1987年(13卷)第0期、．·小鸭传染性浆膜炎疫苗的研究 n、鸭疫巴氏杆菌灭活苗的初步研究北京农业大学兽医学院高福郭玉璞程锡麟小鸭传染性浆膜炎(又称鸭疫巴氏杆菌感染)是造成雏鸭经济损失的重要传染病。为了发展养鸭业，控制和消灭本病，各国禽病学工作者均进行了不懈的努力，以寻求有效的防治方法。其中在摸清本病病原血清型的基础上研制；有效的疫苗是最为有效的方法之一。近年来，英、美等国(E．G．Harry，1979，T．S．Sandhu，1979~H．W．LayLon el al，]984'T．S．Sandhu eL a]，1985)先后制成了几种灭活苗在实验室和野外进行了试验，并取得了较为满意的效果。我们在对从北京、广东地区分自病死鸭的205株鸭疫巴氏杆菌进行了血清型鉴定，并全部确定为NADC分型系统1型的拣础上，试制了福尔马林灭活茁和淄尔马林灭活超声处理苗，并进行了实验室和野外的初步试验。鉴于目前在我国只能用固体培养基培养鸭疫巴氏杆菌，而液体培养基又是简单，快速制苗的基础，我们探索了适合鸭疫巴氏杆菌生长的液体培养基。材料与方海一，液体培养基胰蛋白际胨葡萄糖硫胺素肉汤(简称TGT液体培养基)：胰蛋白际]0g，葡萄绮2g，胰蛋白胨10g，氯化钠5g，硫胺索0．01g，二燕水l，000m]， pH6．9，8磅高压火曲门分钟：二，试驻用鸭及其饲养管理试验用鸭系北京鸭幼鸭，购自鸭场2，该场近年夹未见鸭疫巴氏仟菌感染。鸭只孵出后1闩龄即购入，在隔离舍对网上饲养，室温25~C左右，并给以一定强度的光照，饮自来水，饲料购自鸭场1之啊黄料。使用前用平板拟集反应确定试验鸭均无抗鸭疫巴氏杆菌抗体。三，菌苗制备及其实验窒试验1．菌株复壮：制茁及攻碡用鸭疫巴氏杆菌均分白北京地区自然发病死亡的北京鸭。制苗用菌株勾XJ。：，分自鸭场1，攻毒川菌株力L2，分白鸭场4。两菌株均用平板凝集反应和琼脂凝胶沉淀反应确定为血清学l型。复壮程序如下‘将菌株培养物注入鸭体(2．5周龄)13—24小时后形成菌血症时，见鸭有精神不振等症状时采血(柠檬酸钠抗凝)，血液再经颈部皮下注入另一只健鸭体内。所采之血液同时在巧克力琼脂平板上划线培养，检查鸭疫巴氏杆菌之纯度等。如此反复传四代，毒力即可复壮，自第四代鸭采得的血(抗凝)—20~C冰箱保存该血液，以此来保存菌种。菌株毒力测定：细茧经用TGT液体培养基培养24小时后，调其浓度至OD值(525nm)1．0(约5x10'CFU／mi，用吸管稀释表’面涂布平板法计数，下同)，每鸭经颈部皮下注射1．0mi菌液，每种菌各注15只鸭(2，3，4周龄者各5只)，结果l。致死率为66．?％(10／15)，XJ：：之致死率为60：6(9／15)。；表1XJ真，和L。株毒力测定2．菌苗制备：取出以上保存在—20~C冰箱的XJ：，菌株，接种于巧克力琼脂平板上，挑取菌落接种于TGT液体培养基中(含1—2％血清)，38~C摇振培养，摇振速度为200次／分，培养24—48小时后，取出加入最终浓度为0。4％的福尔马林，充分混匀，置3广C温箱中厌活24小吼1gi摄宠金后即为福尔马林灭活苗。此苗再经4，500rpm离心20分钟，用2—3ml灭菌蒸溜水将沉淀的细菌细胞溶解，置4~C冰箱过夜，次日用超声细胞裂解器间断处理55分钟(20千赫，130瓦)，镜检细菌细胞几乎全部破碎。此即为福尔马林灭活超声处理苗。上述两苗用0．4％福尔马林TGT液体培养墓调浓度至ODs2。nm：1．0(约5x10。CFU／m1)，即可作注射用。3．菌苗检验(1)无菌检验：上述两苗经在巧克力琼脂平板、血液平板、普通肉汤和疱肉培养基中培养检查而无任何细菌生长。(2)安全检验；用两倍免疫剂量(2ml／只)的上述两苗分别注射2．5周龄鸭10只，习、见鸭只出现任何异常反应，也没有引起注射部位可见的组织损伤。’4．免疫程序与试验设计：菌苗经颈部皮下注射小鸭两次。分为四个试验，每个试验又分两个剂量组(第一组每次注射0．5ml，第二组每次注射1．0mi)，故免疫注射组共八组。并设对照组，各组及对照组动物分布见表2。试验1：于乙2周龄时各注射福尔马林灭活苗一次。试验2：于2，3周龄时各注射福尔马林灭话苗一次。试验3：于1，2周龄时各注射福尔马林灭活超声处理苗一次．一51—，中．国兽医；杂志试验4，于2真；3周龄时各注射福尔马林灭活超声处理苗·次。5．攻毒与观察：在最后一次注苗后一周，海只鸭经腿部皮下注射1．OmlL：菌株菌液(浓度，ODs：srim：1．0)。攻毒后观察记录死亡鸭只，14天后对有症状昔剖杀，观察记录病变。病变按严重程度划分为3级，即0哟2级。0级为无眼观变化，1级为纤维素们：丁；包炎；2级为纤维索性心包炎加气囊炎或旰周炎等，死亡或削杀鸭只均作肝＼JL血相脑之细菌分离培养。采用试管凝集反应检测鸭只抗鸭疫巴氏杆菌抗体，每组随机抽样5只采血，共采血4次，即注莳前、第一次注苗后一周，第二次注苗后一周和二周，凝集价取5只鸭之几何平均数。：0．结果处甄应用；x‘检验和方差分析对结果进行统计学检验。为了去除菌株本身毒力差异对保护情况的影响，用如下公式计算了保护指数：保护指数(P1)。；对照组死亡率(％)—免疫组死广率(％)，，。。—·丽丽尔死亡军f死)—-一—”””*PI：卜90tec[ive lndex．四、菌苗野外试验；；1．试验鸭场概况：鸭场3，白1980年以来一直有小鸭传染性浆膜炎流行，有时同小鸭病毒性削：炎混合感染，在不用药物混饲的情况下，2—4周龄的小鸭死亡率很高，尤其是在2周龄左右由网育转力地养的几天内更明显，在每年的2—5月份，小鸭死亡率可达5—25％。表2小鸭1型鸡窿巴氏杆菌福尔马钵灭活苗和挡尔马体灭活舀声处理苗的免疫应答强毒攻击免疫组11：2—，H2—2Hd-tHd、21注：1．对照组分为正常对照组札攻毒对照组，正常对照组指同一批实验鸭既i；免疫也不攻毒，而饲养于环境条件基本相同的隔离舍中，攻毒对照组则指不进行免疫而用强毒攻击者。2。E：-，指试验1之第一剂量组，即注射o．stol者：E：-：指试验1之第二剂量组，即注射1．Oml者：E：—，指试验2之第一剂量组，即注射0．$ml者：Ez-2指试验2之第二剂量组，即注射乙Omi者：E，—：，E，—。，R：—：和比—：类推。2．分组及免疫：对问一批鸭随机地分为免疫组和非免疫组(闷一鸭舍饲育)，免疫组3，000只，非免疫组2，000只，一周龄时颈部皮下注射福尔马林灭活苗1．Oml(表3)。对免疫组’十泎免疫组之死亡鸭只进行削检，记录病变(0—2级)，进行肝、心血和脑的分离培养。寝霉菌苗野外试验保护情况(观察㈠天)表4免疫批与非免疫批观察74天情况2．攻毒：免疫后9天，随机抽取免疫鸭30只，非免疫鸭lo只，在隔离舍内进行攻毒——腿部皮下注射1．OmI鸭疫巴氏杆菌L：菌株24小时TGT培养物(OD。：。二]．0)，观察记录死亡情况，存活者于2周后剖杀，划记病变(0—2级)，肝、心血和脑作分离培养(表5)肭号o0031)嚣丰贮点狱搜艳需丝的论鹎只自1周龄开始观察记录1，l天的死亡情况(丧4)一，液体培养基自制TGT液体培养基可以很好一52一肥 m删况咖00¨0表5菌苗野外试验攻毒结果；；；竺目别＼动物数目死亡数死亡率％存活而有病变者保护界数免疫组非免疫组．．96嘲地使鸭疫巴氏杆菌生长。在摇振培养下，24—48小时的培养物光密度值(525nm)可达1．0。若再加入少许血清(1—2％)，则生长更为旺盛，24—48小时的培养物光密度值可达1．5，甚或大于2．0。由于TGT液体培养基是国内首次找到的适合鸭疫巴氏杆菌生长的液体培养基，故其确切机制有待今后进一步探讨。二、菌苗实验室试验结果1．菌苗保护情况：试验1和试验3在对照组死亡率70％(?／10)的情况下，试验2和试验4在对照组死亡率60％(6／10)的情况下，均表现了较好的保护，详见文2。试验1之第二剂量组(1．Om]开)、试验3之两个剂量组保护100％，保护指数达100。经与对照组进行x。检验，差异极显著[(X。；9．8659)>X。真L：(6．635))。试验1之第一剂量纽(0．5ml者)保护90％，保护指数为85．71，较第二剂量组稍差。但其与对照组进行X。检验，差)f板显苫C(X。；7．5)>X。。二：)，两剂量之保护情况经X。检验，差异不显著[(X。：]．0526)X‘。．o：)。试验4之第一剂量组(0．5m1)保护90％，保护指数为83．33，经与对照组进“X。检验，差异显著[X’。．。。